乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)产品简介：
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH或LD)属于氧化还原酶，能够催化氢氧原子或电子从一种底物转移到另一种底物上乳酸脱氢酶是糖酵解和糖异生的一个极其重要的酶，含有锌离子，广泛分布于人和动物组织、植物和微生物，能可逆的催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之间的氧化还原反应。其反应公式：乳酸+NAD+→丙酮酸+NADH+H+。其中：L→P为正向反应；P→L为逆向反应。
乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)其检测原理是以NAD为受氢体，乳酸脱氢酶催化乳酸脱氢生成丙酮酸，丙酮酸与二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度呈正比，酶标仪检测440nm处吸光度，通过测得的丙酮酸含量计算酶的活性。该方法的优点是：1、试剂原料容易获得；2、较为经典的方法；3、适用于手工操作。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
产品组成：
编号 名称 | TE0158 50T | TE0158 100T | Storage |
试剂(A): 丙酮酸标准(50mmol/L) | 1ml | 1ml | 4℃ 避光 |
试剂(B): LDH Assay buffer | 3ml | 6ml | 4℃ 避光 |
试剂(C): NAD Buffer | 0.3ml | 0.5ml | -20℃ |
试剂(D): 二硝基苯肼溶液 | 1.5ml | 3ml | 4℃ 避光 |
试剂(E): 碱性显色液 | 5ml | 10ml | RT |
试剂(F): LDH保护剂 | 1支 | 1支 | 4℃ 避光 |
试剂(G): LDH保护稀释液 | 1.5ml | 1.5ml | RT |
使用说明书 | 1份 |
自备材料： 1、蒸馏水
2、实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等
3、研钵或匀浆器
4、离心管或试管
5、低温离心机
6、恒温箱或水浴锅
7、分光光度计、比色杯 编号 名称 TO1123 50T Storage 试剂(A): NO2-标准(1mM) 1ml 4℃ 试剂(B): O2- Lysis buffer 125ml 4℃ 试剂(C): 羟胺溶液 30ml 4℃ 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml 4℃ 避光 使用说明书 1 份
乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)操作步骤(仅供参考)：
1、准备样品： ①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取 1~1.5g， 加入 2ml 预冷的 O2- Lysis buffer 后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃ 10000g 离心 10min， 上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测 定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高浓度的超氧阴离子自由基，可以使用 O2- Lysis buffer 进行恰当的稀释。
2、配制系列 NO2-标准溶液：取出 NO2-标准(1mM)恢复至室温后，以 NO2-标准(1mM) 按下表继续稀释：
3、O2-加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意 避免产生气泡。如果样品中的超氧阴离子自由基浓度过高，可以减少样品用量或适当稀 释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。
4、O2-测定：以空白调零，比色杯光径 1cm，分光光度计测定标准管、测定管 530nm 处 吸光度(即为 A 标准、A 测定)。
计算： 以系列 NO2-标准(1~6 号)含量(μM)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 NO2-标准(1mM) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水 0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 NO2-含量(μM) 10 20 30 40 50 60 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 蒸馏水 1 — — 系列 NO2-标准(1~6 号) — 1 — 待测样品 — — 0.25 O2- Lysis buffer — — 0.25 羟胺溶液 — — 0.5 混匀，25℃水浴孵育 20min。 氨基苯磺酸显色液 0.5 0.5 0.5 萘胺显色液 0.5 0.5 0.5 混匀，30℃水浴孵育 30min。根据测定管的吸光度进而计算 NO 2-含量。
根据如下公式计算具体样品中超氧阴离子自 由基(O2-)的含量： 植物组织样品 O2-(μM/g)=2×n×VT/(W×VS) 血清、尿液等样品 O2-(μM/ml)=2×n×N/VS 超氧阴离子的产生速率的定义：每分钟每克鲜重组织产生的超氧阴离子的物质的量，计 算公式如下： 超氧阴离子产生速率【μmol/(min*g)】=2×n×VT/(W×t×VS) 测得样品中蛋白质含量后，可用下面公式表示： 超氧阴离子产生速率【μmol/(min*mg)】=2×n×VT/(m×t×VS) 式中：2=NO2-与 O2-间的化学计量数 n=从标准曲线上查得的 NO2-含量(μM) VT=超氧阴离子自由基提取液总体积(ml) N=样品稀释倍数 W=样品鲜重(g) m=样品中蛋白质含量(mg) t=样品与羟胺的反应时间(min)=20 VS=测定时加入提取液体积(ml)
乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(二硝基苯肼微板法)注意事项：
1、 实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于 4℃。
2、 如果样品中含有较多的叶绿素，会干扰测定结果，可在加入羟胺溶液 25℃水浴孵育 20min 后用等体积乙醚或三氯甲烷萃取叶绿素，再行显色反应。
3、 如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，但应考虑酶标仪的最大检测体积。
4、 所测样本的浓度过高，应用 O2- Lysis buffer 稀释样品后重新测定。
5、 氨基苯磺酸显色液和萘胺显色液有强烈的刺激性，尽量在通风条件好的地方操作，用后 需拧紧瓶盖，避免挥发。
有效期：6 个月有效。4℃运输，4℃保存。
相关产品： 附：参考标准曲线范围： Leagene 测定 NO2-标准 10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200μM 在 530nm 的吸光度，据此做出其标准曲线如下： 根据结果可以看出 NO2-标准在 160μM 以上时，OD 值会有偏差，因此样品的 O2-应小于 320μM
