乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)

乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)

产品简介：

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)的系统名为乙醇：辅酶I氧化还原酶（alcohol：NAD+ oxidoreductase），大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应： CH3CH2OH+ NAD+→ CH3CHO +NADH+ H+。在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参乙醇脱氢酶与体内乙醇代谢，是人和动物体内重要的代谢酶，作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶，它在很多生理过程中起着重要作用。丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醇脱氢酶(ADH)是乙醇发酵途径的关键酶，无氧呼吸途径代谢产物的过程积累对细胞产生毒性，影响线粒体结构和三羧酸循环的相关酶活性。

乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)检测原理是在弱碱条件下，以乙醛为底物，乙醛在ADH催化下被NADH还原为乙醇，ADH每催化1分子乙醛消耗1分子NADH，通过分光光度比色法(酶标仪)测定340nm处吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出乙醇脱氢酶活性水平，该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中乙醇脱氢酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

自备材料： 1、蒸馏水

2、实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等 

3、研钵或匀浆器

4、离心管或试管

5、低温离心机 

6、恒温箱或水浴锅 

7、分光光度计、比色杯 编号 名称 TO1123 50T Storage 试剂(A): NO2-标准(1mM) 1ml 4℃  试剂(B): O2- Lysis buffer 125ml 4℃ 试剂(C): 羟胺溶液 30ml 4℃ 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml 4℃ 避光 使用说明书 1 份  

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品： ①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取 1~1.5g， 加入 2ml 预冷的 O2- Lysis buffer 后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃ 10000g 离心 10min， 上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测 定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高浓度的超氧阴离子自由基，可以使用 O2- Lysis buffer 进行恰当的稀释。 

2、配制系列 NO2-标准溶液：取出 NO2-标准(1mM)恢复至室温后，以 NO2-标准(1mM) 按下表继续稀释： 

3、O2-加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意 避免产生气泡。如果样品中的超氧阴离子自由基浓度过高，可以减少样品用量或适当稀 释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。

4、O2-测定：以空白调零，比色杯光径 1cm，分光光度计测定标准管、测定管 530nm 处 吸光度(即为 A 标准、A 测定)。 

计算： 以系列 NO2-标准(1~6 号)含量(μM)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 NO2-标准(1mM) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水 0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 NO2-含量(μM) 10 20 30 40 50 60 加入物(ml) 空白管 标准管 测定管 蒸馏水 1 — — 系列 NO2-标准(1~6 号) — 1 — 待测样品 — — 0.25 O2- Lysis buffer — — 0.25 羟胺溶液 — — 0.5 混匀，25℃水浴孵育 20min。 氨基苯磺酸显色液 0.5 0.5 0.5 萘胺显色液 0.5 0.5 0.5 混匀，30℃水浴孵育 30min。根据测定管的吸光度进而计算 NO 2-含量。

根据如下公式计算具体样品中超氧阴离子自 由基(O2-)的含量： 植物组织样品 O2-(μM/g)=2×n×VT/(W×VS) 血清、尿液等样品 O2-(μM/ml)=2×n×N/VS 超氧阴离子的产生速率的定义：每分钟每克鲜重组织产生的超氧阴离子的物质的量，计 算公式如下： 超氧阴离子产生速率【μmol/(min*g)】=2×n×VT/(W×t×VS) 测得样品中蛋白质含量后，可用下面公式表示： 超氧阴离子产生速率【μmol/(min*mg)】=2×n×VT/(m×t×VS) 式中：2=NO2-与 O2-间的化学计量数 n=从标准曲线上查得的 NO2-含量(μM) VT=超氧阴离子自由基提取液总体积(ml) N=样品稀释倍数 W=样品鲜重(g) m=样品中蛋白质含量(mg) t=样品与羟胺的反应时间(min)=20 VS=测定时加入提取液体积(ml) 

乙醇脱氢酶(ADH)检测试剂盒(乙醛微板法)注意事项：

1、 实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于 4℃。

2、 如果样品中含有较多的叶绿素，会干扰测定结果，可在加入羟胺溶液 25℃水浴孵育 20min 后用等体积乙醚或三氯甲烷萃取叶绿素，再行显色反应。 

3、 如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，但应考虑酶标仪的最大检测体积。 

4、 所测样本的浓度过高，应用 O2- Lysis buffer 稀释样品后重新测定。 

5、 氨基苯磺酸显色液和萘胺显色液有强烈的刺激性，尽量在通风条件好的地方操作，用后 需拧紧瓶盖，避免挥发。 

有效期：6 个月有效。4℃运输，4℃保存。  

相关产品： 附：参考标准曲线范围： Leagene 测定 NO2-标准 10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200μM 在 530nm 的吸光度，据此做出其标准曲线如下： 根据结果可以看出 NO2-标准在 160μM 以上时，OD 值会有偏差，因此样品的 O2-应小于 320μM